Димитрис Митропулос родился в Афинах. Родители готовили его к карьере священника, затем пытались определить в моряки. Но Димитрис любил музыку и сумел убедить всех, что именно в ней — его будущее. Уже в 11 лет он проводил у себя дома каждую субботу музыкальные собрания. К этому времени относится его первое сочинение — соната для скрипки и фортепиано.
Музыкальное образование Митропулос получает вначале в Афинской консерватории, потом в Брюсселе и, наконец, в Берлине у Ферруччо Бузони. В 1921–1925 годах был ассистентом дирижёра Берлинской оперы Эриха Клайбера. В дальнейшем занимает несколько музыкальных должностей в Греции и продолжает часто выступать в Германии.
В 1930 году на концерте с Берлинским филармоническим оркестром исполняет 3-й фортепианный концерт Прокофьева, одновременно дирижируя из-за клавиатуры, — практика, обычная для старинного музицирования и довольно неожиданная для этого времени.
В 1936 году Митропулос впервые выступает в США с Бостонским оркестром и в конце 1930-х фактически переезжает в Америку. Гражданство получает в 1946 году. В 1937–1949 годах маэстро занимает пост главного дирижёра Миннеаполисского симфонического оркестра. В 1949 году возглавляет Нью-Йоркский филармонический оркестр на пару с Леопольдом Стоковским, в 1951–1957 годах — единолично, уступив этот последний пост своему ученику Леонарду Бернстайну. Одновременно с 1954 года и до самой смерти Митропулос руководит оркестром нью-йоркского театра Метрополитен-опера.
Годы работы в США стали для Митропулоса периодом расцвета. Он слыл превосходным интерпретатором классики, горячим пропагандистом современной музыки. Митропулос первым представил американской публике множество сочинений европейских композиторов; среди премьер, прошедших в Нью-Йорке под его управлением, — скрипичный концерт Шостаковича (с Давидом Ойстрахом) и Симфония-концерт Прокофьева (с Мстиславом Ростроповичем). Также пропагандировал сочинения Малера, Штрауса, Прокофьева, Воан-Уильямса, Берга, Шёнберга.
Оперный репертуар Митропулоса-дирижёра включал среди прочего оперы русских композиторов («Евгений Онегин» Чайковского, «Борис Годунов» Мусоргского). Как пианист, Митропулос впервые исполнил и записал фортепианный концерт Кшенека.
Митропулос скончался в Милане во время репетиции Третьей симфонии Густава Малера — одного из важнейших авторов его своего репертуара.
Димитрис Митропулос был известен своей фотографической памятью, позволявшей ему практически не пользоваться партитурами (не только на концертах, но и на репетициях), и почти монашеским образом жизни, вызванной глубокой приверженностью греческому православию.
Митропулоса нередко называли «загадочным дирижером». Действительно, его манера внешне была на редкость своеобразной — он дирижировал без палочки, крайне лаконичными, порой почти незаметными публике движениями рук и кистей. Но это не мешало ему достигать огромной выразительной силы исполнения, целостности музыкальной формы.