Мысливечек учился в Праге, позднее в Венеции. В 1762 году он опубликовал 6 симфоний, которым дал названия первых шести месяцев. С 1763 года путешествовал по Италии и Германии.
В Парме в 1764 году была представлена его первая опера «Беллерофонт», за которой последовали тридцать других, написанных по заказу различных итальянских театров. Среди них «Монтесума» (1771), «Великий Тамерлан», «Эдип» (1775), «Олимпиада» (1778), «Армида» (1779). Последняя опера — «Медонт, царь Эпира» (1780) считалась утерянной, но была обнаружена в Ленинграде. Среди других произведений Мысливечека интерес представляет оратория «Авраам и Исаак» (1777).
Творчество композитора, как говорят исследователи, во многом предвосхитило стиль В. А. Моцарта, с которым Мысливечек был в дружеских отношениях.
В своей музыке Йозеф Мысливичек использовал чешские народные мелодии. Среди его работ — оперы «Медея» (1764), «Беллерофонт» (1767), симфонии, концерты, оратории, инструментальные сочинения, мессы и другие произведения.
В 1771 году Мысливечек был избран членом Болонской академии.